cDC 분화 및 발달 #

cDC는 pDC가 아닌 모든 DC를 나타냅니다. cDCs는 대부분의 림프계 및 비 벼룩 조직에 서식하는 조직 조혈 세포의 작은 부분 집합을 형성합니다. cDC는 조직 손상을 감지하고, 환경 및 세포 관련 항원을 포착하고, 탐식 항원을 처리하여 T 림프구에 제공하는 향상된 능력을 갖추고 있습니다. 이러한 과정을 통해 cDC는 조직을 침해하고 자체 항원에 대한 내성을 강화하는 모든 외부 항원에 면역을 유도한다. 이중 cDC1은 CD8+ T cell 에 antigen cross-presentation을 담당하며, Irf8, Batf3, Nfil3, Id2 에 의해 분화와 발달이 조절된다. 반면, CD4+ 에 antigen presenting의 주요 기능을 갖는 cDC2는 밝혀진 대표적인 TFs가 Irf4 정도이며, Id2는 cDC1과 cDC2의 분화 발달에 함께 작용하는 것으로 알려져 있다. 이에 자세한 메커니즘을 cDC2 분화 발달을 바탕으로 하여 알아보았다.

figure 1. DC 분화에 관여된 TFs

cDC2 발달의 주요 전사 조절인자 Zeb2 #

cDC1과 함께 antigen presenting의 주요 기능을 갖는 cDC2는 CD4+ T cell을 자극하여 2차 면역 체계를 증폭하는 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 앞서 밝혀진 cDC2 lineage로의 분화에 관여되는 것으로 밝혀진 TF로는 RelB, Notch2, Klf4, Irf4등이 있으며, 최근 들어 microarray를 비롯한 RNAseq 분석을 통해 DC development에 자주 관여되는 유전자로 Zinc finger E box-binding homeobox 2 (Zeb2)가 알려졌지만, 그 정확한 메커니즘은 밝혀지지 않았다. Zeb2는 본래 embryonic development, wound healing 및 cancer progression에 관여하는 것으로 알려졌으며, NK cell의 maturation을 비롯해 T cell의 terminal differentiation에도 필수적인 TF로 알려져 있다. Scatt, C.L. (2016)이 발표한 논문에서는 다양한 mouse mutant line을 이용해 cDC2 및 pDC로의 분화에 Zeb2가 어떻게 관여하는지 연구하였다.

High expression of Zeb2 beyond the CDP stage and in subsets of mature DCs #

cDC2 및 pDC 분화 시 높은 발현 패턴을 보인다는 Zeb2 의 앞선 연구 결과를 일차적으로 확인하기 위해 BM과 spleen 에서 추출한 세포를 FACS를 이용해 각 lineage별 세포로 구분한 후 Zeb2의 발현을 qPCR 방식으로 확인한 결과 예상과 동일하게 pDC, cDC2에서 높은 발현을 확인하였다(Figure 2 A). 이후 mutant mouse를 이용해 Zeb2의 발현 정도에 따라 총 5단계로 구분하여 DC lineage 분화에 미치는 영향을 연구하였다(Figure 2 B, C). 결과, Zeb2의 정상 발현을 기준으로 저발현 됐을 때 pDC로의 분화가 현저히 줄어든 반면, 과발현 되었을 때는 pDC로 분화된 세포 수가 현격히 증가하지는 않음을 확인하였다(Figure 2 D, E).

figure 2. Zeb2 expression levels regulate pDC and cDCs

pDC로의 분화 외에 추가적인 cDC subset간의 분화 조절을 확인하기 위해 cDC1, cDC2로의 분화 세포 수를 확인한 결과 과발현되는 mouse line에서는 cDC2로 분화된 세포가 많지만, 저발현 됐을 때는 cDC1으로 분화된 세포가 많음을 확인하였다(figure 2, F, G, H). 특히 Zeb2의 과발현은 정상적인 cDC1과 cDC2가 아닌 double potential cDCs population이 확인되어 Zeb2의 발현이 이들 lineage 분화에 크게 관여되고 있음을 확인하였다(figure 2, I).

Zeb2 expression differentially affects subsets of tissue-resident cDC2s. #

Bone marrow가 아닌 tissue-resident 에서의 Zeb2의 분화 조절을 확인한 결과 liver, lung, Small Intestine(SI), MLN resident cDCs, MLN Migratory cDC 모두 앞선 BM 결과와 동일하게 조절되고 있음을 확인하였다. 다만, SI의 경우 기존에 CD103과 SIRPα 마커로 확인된 CD103 positive, SIRPα positive population이 존재하는데 Zeb2의 발현 차에 따라 큰 변화가 없는 population임을 확인하였다.

DC-intrinsic effects of Zeb2 expression on cDC commitment revealed by competitive BM chimerism. #

cDC commitment에서 Zeb2 발현의 DC-intrinsic 효과를 시험하기 위해 Zeb2 발현을 과발현과 정상, 저발현의 3단계 chimeric mouse를 구축하여 spleen을 비롯해 lung, liver, SI에서 각각 분화된 cell lineage를 조사하였다. 결과 앞선 결과와 동일하게 Zeb2의 저발현 mouse에서는 cDC1 분화가 많았으며, 정상 발현 및 과발현되었을 경우에는 모두 cDC2로의 분화가 많음을 확인함으로써 chimeric mouse에서 Zeb2의 발현이 우점 되는 것을 확인하였다(figure 3).

figure 3. DC-intrinsic effect of Zeb2 expression on cDC commitment revealed by competitive BM chimerism.

Zeb2 expression regulates cDC development. #

Progenitor에서부터 cDC subset 발달 동안의 Zeb2의 분화 조절 기능을 확인하기 위해 BM에서 pre-cDC와 spleen pre-cDCs 그리고 분화가 완료된 Late-Cd11cCRESpleen cDCs에서의 Zeb2 발현에 따른 cDC subset population을 조사하였다. 결과 BM pre-cDC 단계에서는 Zeb2의 발현 차이에 큰 영향이 없이 cell population이 유사하게 나타났지만, spleen pre-cDCs에서는 Zeb2 발현이 높아 짐에 따라 cDC2 population이 증가함을 확인하였다. 분화가 완료된 Late-Cd11cCRESpleen cDCs 에서도 역시 spleen pre-cDC와 유사하게 Zeb2의 과발현으로 cDC1 population이 상대적으로 감소하고, cDC2 population이 증가함을 관찰하여 Zeb2는 cDC development동안 cDC1과 cDC2 population의 균형을 유지하는 것으로 예측 되었다(figure 4).

figure 4. Zeb2 expression regulates cDC development.

Minimal changes in transcriptomes of mature cDC subsets. #

Zeb2와의 상호작용을 통해 cDC 분화에 관여하는 후보 유전자를 확인하기 위해 전사체 분석을 수행했으나, Zeb2의 과발현 여부 및 발현 차이에 의해 확인되는 차등 발현 유전자가 거의 없음을 확인하였다. 다만, 다양한 cell lineage 마커를 통해 확인한 결과, 비정상적인 Zeb2의 발현은 cDC2 및 cDC1 세포가 T cell, Macrophage, pDC, B cell 등과 같이 다양한 lineage로의 분화 potential을 갖게 함을 확인하였다.

Zeb2 acts as a cDC subset fate switch by regulating Id2 expression. #

앞선 연구를 통해 구축된 많은 전사체 정보를 이용해 cDC1 및 cDC2 lineage에 association 된 유전자를 각각 선별하였고 이들 유전자들과 Zeb2와의 상관관계를 확인하고자 Zeb2 과발현, 정상, 저발현 시에 해당 유전자들의 발현이 어떻게 변화되는지를 확인하였다. 분석 결과 몇몇 유전자에서 발현이 차이를 보이긴 했으나 대부분 유전자들은 큰 차이를 보이지는 않았다. 다만 기존의 cDC1 lineage 발달에 관여하는 것으로 알려진 Id2의 경우 Zeb2 발현에 의해 큰 차이가 있음이 확인되었다(figure 5 F). Zeb2가 과발현되고 있는 cDC2 세포에서 Id2의 발현은 현저히 낮지만, 같은 cDC2 라도 Zeb2의 발현이 낮은 곳에서는 Id2의발현이 높음을 관찰할 수 있었다. 또한 Pre-cDC1에서는 Zeb2발현 차와 상관없이 높은 Id2 발현이 관찰되는 반면, Pre-cDC2에서는 Zeb2의 과발현 시에는 Id2의 발현이 관찰되지 않고, 저발현 시에는 약간의 발현이 확인되었다(figure 5, G) 이러한 결과는 Id2의 upstream에 존재하는 E Boxes motif에 Zeb2의 binding이 수반되어 Id2의 발현을 저해하는 것으로 이해 되었다(figure 5, I). 특히 E Boxes motif는 두 개가 존재했는데, 이중 pDC에서는 a motif가 더욱 강력하게 작용하는 것으로 확인되었고 cDC2에서는 비슷한 작용이 있는 것으로 확인되었다(figure 5, J).

figure 5. Zeb2 acts as a cDC subset fate switch by regulating Id2 expression.

Conclusion: Zeb2 is a inhibitor of Id2. #

최종적으로 Pre-DC에서 Zeb2의 과발현은 Id2의 발현을 저해하게 되는데, 이는 Id2의 upstream에 inhibitor로써 작용하여 Id2의 발현을 억제하고 그에 따라 antagonist로 알려진 E2-2의 발현이 상대적으로 증가하여 pDC로의 분화와 cDC2로의 분화가 각각 유도한 것으로 확인되었다 (figure 6).

figure 6. The scheme of Zeb2 regulation in DC development.