pDC (Plasmacytoid dendritic cells) 발달 #

pDC 발달의 주요 전사 조절인자 E2-2 #

pDC는 BM에서 최종 발달이 완료되어 blood 상에서 type I interferon response를 수행하는 것으로 알려져 있다. 이에 관여되는 것으로 보고된 전사조절인자로는 Irf8과 Bcl11A를 비롯해 가장 대표적인 E2-2가 알려져 있다. 현재까지 알려진 E protein에는 TCF3, TCF4, TCF12가 있으며 이들 모두는 두 개의 isoform이 확인되어 각 isoform별로 다른 단백질 도메인 구성으로 기능상의 차이를 보인다.

figure 1. E2-2, TCF4 domain information.

기본적인 E protein의 도메인 구성은 canonical activation domain인 AD1/ AD2가 존재하고 TFIID-interacting activation domain인 AD3, transcriptional cofactors의 binding site인 PCET/DES domain으로 구성되어 있어, 이들 domain들의 조합으로 기능을 수행하는데 isoform별로 차이가 있음이 TCF3의 B cell development에서 확인되었다. 앞선 연구를 통해 E2-2 (TCF4)는 Id2와의 antagonist로 작용하여 cDC1과 pDC lineage를 조절한다는 보고가 있었으나 두 개의 서로 다른 isoform들의 상세한 조절 메커니즘은 Grajkowska(Immunity., 2017)에 의해 상세히 연구 보 되었다.

The Long Isoform of Tcf4 is Expressed Specifically in pDCs. #

Tcf4의 두 가지 isoform을 대상으로 각 DC subset lineage에서의 발현 차이를 확인하고자 T cell, B cell, cDC1, cDC2, pDC 에서의 발현량을 qRT-PCR 방식으로 확인하였다. 분석 결과 Tcf4는 기본적으로 다른 subset에 비해 pDC에서 상대적인 높은 발현을 보임을 확인하였으며, B cell을 비롯한 다른 subset에서도 약간의 발현이 함께 관찰되는 Short Tcf4 (Tcf4S)와는 다르게 Long Tcf4 (Tcf4L)는 오직 pDC 에서만 높은 발현을 관찰되는 특징을 보였다(figure 2, A, C). 이러한 발현 패턴은 pDC development 초기 단계인 BM과 성숙 후인 spleen 세포에서도 Tcf4S 에 비해 Tcf4L 의 발현 높게 유지됨을 확인하였다(figure 2, D). 뿐만 아니라 cDC와 pDC subset에서의 Tcf4S 와 Tcf4L 의 발현 비율 차이를 Western blot 및 RNA-seq을 통해 확인한 결과 Tcf4S 에 비해 Tcf4L 의 비율이 높음을 함께 확인하였다(figure 2. E, F). 결국 Tcf4는 특이적으로 pDC 발달 초기 단계부터 발현이 높게 유지되며, Tcf4S 에 비해 Tcf4L 의 발현이 더 높게 유지됨을 확인하여 pDC 분화에 직접적인 관련성을 제시하였다.

figure 2. The long isoform of Tcf4 is expressed specifically in the pDCs.

DC subset에서의 Tcf4L의 발현 차이를 보다 직접적으로 확인하기 위해 Tcf4L의 intron 영역에 SA-LacZ reporter gene을 삽입하여 β-galactosidase activity를 측정한 결과 pDC에서만 유일하게 발현이 증가 됨을 확인 하였다(figure 3. G). 앞선 연구로 알려진 Tcf4의 antagonist로 작용하는 Id2 와 Tcf4L의 상호작용을 확인하고자 Tcf4L (βGal)을 이용하여 primary immune cells에서 각각 분화된 세포 population을 확인하였다. 결과, cDC1 subset에서는 두 개의 population이 관찰되었는데, Id2의 발현이 낮은 cDC1 population에서는 Id2의 발현이 높은 cDC1 population에 비해 상대적으로 Tcf4L (βGal)의 발현이 높게 관찰됨을 확인 하였다(figure 3, H). 이러한 사실로 미뤄볼 때, Tcf4L 은 Id2와의 직접적인 상호작용을 통해 pDC 및 cDC1 development에 관여되고 있음을 짐작하게 하였다.

figure 3.The expression of Tcf4L was related with Id2 expression.

Both Tcf4 Isoforms are required for optimal pDC Development in vitro. #

Tcf4의 두 isoform 각각의 pDC development 동안의 역할을 확인하기 위해 progenitor cell line에서 flt3L dependent pDC와 cDC로 분화되는 cell line을 구축하여 정상적인 pDC와 cDC분화를 확인하였다(figure 4, A, B). 이후 CRISPR/Cas9을 이용한 genome editing으로 Tcf4L과 Tcf4S 그리고 Tcf4 common deletion 모델을 구축하여 각 DC lineage development를 확인하였다(figure 4, C). 결과, cDC lineage로의 분화에서는 Tcf4 common deletion (Tcf4 Del)에서만 분화가 보다 촉진되고 나머지 Tcf4LDel, TCf4SDel 단독 deletion에서는 큰 변화가 관찰되지 않았다. 반면, pDC lineage에서는 Tcf4 Del 에서 현저한 감소가 관찰되고 Tcf4LDel 에서도 비교적 많은 감소가 관찰되었으나, Tcf4 Del 만큼 많은 감소는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 Tcf4S 도 pDC development에 일정 부분 관여하고 있으며, pDC development에 두 isoform 모두 필수적으로 요구됨을 시사한다(figure 4, D, E).

figure 4. Both Tcf4 isoform are required for optimal pDC development in vitro.

Tcf4L is required for optimal pDC development in vivo. #

pDC development 동안의 Tcf4L의 기능을 in vivo 상태에서 확인 하기위해 LacZ gene trap으로 Tcf4L deletion line을 구축하였다. 정상 상태와 비교하여 one allele deletion, double deletion일 때의 각 pDC development 비율을 조사한 결과, deletion 정도에 따라 development 비율이 감소 됨을 확인하였다(figure 11, A). 그뿐만 아니라 mature한 spleen보다 immature BM에서 Tcf4L의 deletion은 pDC development에 더 큰 영향을 주는 것으로 확인 되었다(figure 5, B). 결과, cDC lineage로의 분화에서는 Tcf4 common deletion (Tcf4 Del)에서만 분화가 보다 촉진되고 나머지 Tcf4LDel, TCf4SDel 단독 deletion에서는 큰 변화가 관찰되지 않았다. 반면, pDC lineage에서는 Tcf4 Del 에서 현저한 감소가 관찰되고 Tcf4LDel 에서도 비교적 많은 감소가 관찰되었으나, Tcf4 Del 만큼 많은 감소는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 Tcf4S 도 pDC development에 일정 부분 관여하고 있으며, pDC development에 두 isoform 모두 필수적으로 요구됨을 시사한다(figure 5, D, E).

figure 5.Tcf4L is required for optimal pDC development in vivo.

Tcf4L is expressed in progenitors and is upregulated during pDC commitment. #

pDC development 동안의 Tcf4L의 발현이 어떻게 조절되는지 확인하기 위해 HSC, MP, CDP, pDC등 순차적인 progenitor 단계의 population에서의 TCF4의 발현을 확인하였다. 확인 결과 HSC 단계부터 점진적인 발현의 증가 관찰되면서 pDC 단계에서 급격한 증가세를 보였다. Development 단계를 날짜 단위로 세분화하여 확인해 보면, DC development는 day4에서 변화를 시작하지만 TCF4의 발현은 그 이전인 day3에서부터 발현의 증가를 관찰할 수 있었다. 특히, 분화 초기 단계인 day0, 3에서 Tcf4S의 발현이 다소 높게 유지되던 것이 day4에서 Tcf4L의 발현이 더 높아지는 경향을 보였으며 이는 maturation이 되는 day6 까지 유지됨을 보였다. 이는 이미 pDC development를 위해 TCF4는 pDC commitment 동안 초기 전구체 단계부터 준비되고 있고, maturation 될 때까지 upregulation됨을 확인할 수 있다(figure 6).

figure 6.Tcf4L is expressed in progenitors and is upregulated during pDC commitment.

A 3’ Enhancer Is Required for Tcf4 Expression during pDC Development. #

pDC development 초기부터 maturation 단계까지 Tcf4L의 발현이 높게 유지됨을 확인한 후 이를 조절하는 메커니즘을 확인하기 위해 ATAC_seq을 통해 Tcf4 주변의 (1.5Mb까지) cis-acting element를 조사하였다. DC2, DC1 에 비교하여 pDC 에서 특이적으로 확인되는 elements를 조사한 결과 3’과 5’쪽에서 몇몇 enhancer를 발견하였다(figure 7, A). 1차 3’ enhancer를 target으로 하여 progenitor를 포함한 NK, DC1, DC2, pDC에서의 3’ enhancer를 확인한 결과 앞선 연구결과와 동일하게 pDC에서 가장 강한 signal이 확인되고, progenitor에서도 함께 확인되었다. 3’ enhancer의 signal은 Tcf4L의 TSS와 signal과 동일하게 나타나는 경향성을 보였으며, ChIP_seq을 이용한 DC development day4에서도 같은 결과를 얻을 수 있었다(figure 7, B, C, D). 이후 CRISPR/Cas9을 이용해 3’ enhancer의 deletion을 유도한 후 pDC development 비율을 확인한 결과, 정상적인 control에 비해 현저히 낮은 pDC development를 확인할 수 있었다. 이러한 3’ enhancer의 Tcf4 upregulation 효과는 Tcf4S보다는 Tcf4L에서 더 큰 영향을 받는 것으로 확인 되었다(Figure 7, E, F).

Figure 7. A distal 30 enhancer controls Tcf4 upregulation in pDCs.

Tcf4 Expression and pDC Development Are Regulated by BET-Dependent Enhancers. #

앞서 3’ enhancer와 함께 Tcf4 발현에 영향을 미치는 5’ enhancer를 추가로 확인하기 위해 ChIP_qPCR과 TCF4의 qRT-PCR를 통해 직접적으로 각 enhancer와 Tcf4의 발현 correlation을 확인하였다. 결과 3’ enhancer와 같이 pDC development 시기에 맞춰 함께 TCF4 발현을 증가시키는 5’ enhancer를 추가로 확인하였다(figure 8, A, B). 앞선 연구에서 human에서의 transformed pDC는 Tcf4의 발현과 activation이 BET domain-containing protein (BET)에 dependent 하게 조절된다고 보고된 바 있다. 이들 BET protein은 super-enhancer의 activity에 매우 중요한 transcriptional cofactor로 알려져 있다. 따라서 현재 canonical pDC에서도 이들 BET dependent 한 조절이 진행되는지를 확인하기 위해 BET inhibitor인 JQ1을 처리하여 그 영향을 확인 하였다. 그 결과 BET의 binding 억제는 pDC development를 매우 현저하게 낮춰주었으며, 이를 통해 BET dependent 한 Tcf4 발현 조절이 3’ enhancer와 5’ enhancer를 통해 이뤄지고 있음을 확인하였다(figure 8, C, D).

figure 8. Dynamic regulatory landscape of Tcf4 in pDC development.

TCF4 is a key player for pDC development. #

Grajkowska는 본 연구를 통해 TCF4 스스로 다양한 메커니즘을 통해 pDC development를 조절하고 있음을 보였다. TCF4는 두 개의 isoform 형태로 pDC development 초기 단계부터 발현되어 lineage 분화를 조절하는데, 특히 “long” TCF4 isoform은 pDC specific한 형태를 보임을 확인하였다. 이러한 조절은 TCF4의 3’ enhancer와 5’ enhancer를 통한 positive feedback regulation으로 진행되며, pDC development의 key player로써 작용하고 있다(figure 9).

figure 9. TCF4 regulation for pDC development.

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