16s rRNA #

16S rRNA 유전자는 bacteria나 archea에서 발견되는 prokaryotic DNA이다. 이 rRNA는 Ribosome을 구성하고 있다. rRNA의 첫 글자의 r이 바로 이 ribosome을 의미한다. Ribosome은 큰 부분(large subunit, LSU)과 작은 부분(small subunit, SSU)으로 나뉘어져 있는데 이 두 개의 subunit이 샌드위치처럼 mRNA를 끼워서 translation을 한다. 즉, 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rRNA로, 1,500 뉴클레오타이드 정도의 길이를 갖는다.

16s rRNA 기능 #

• 30S 소단위체가 샤인-달가노 서열을 인식하고 결합할 수 있도록 한다.
• 번역개시인자3(IF3) 및 tRNA의 3'CCA 말단과 결합한다.
• 두 리보솜 소단위체가 결합할 때 50S 소단위체의 23S 리보솜 RNA와 상호작용한다.
• 16S rRNA 유전자의 모든 부분이 같은 변이 속도를 갖지 않으며, 약 1,550 bp의 길이를 가지고 있고 변이 부위와 보존 부위가 번갈아 나타난다. 따라서 보존 부위로 연관 관계가 먼, 생명체 분화 초기의 분류에 이용할 수 있는 반면, 변이 부위는 종(species) 사이의 비교에 이용할 수 있다.

16s rRNA 생산 #

• 16S 리보솜 RNA는 원행생물의 유전체 DNA에서 전사되어 만들어진다.

16s rRNA 동정목적 #

• 미생물 분류는 형태적 특징, 생리·생화학적 성질과 상태, 화학 분류학적 성질과 상태 등을 이용하여 구분하는 것이 일반적이지만, 이와 같은 방법을 이용하면 많은 시간을 필요로 한다. 또한 분류가 힘든 경우나, 정확하지 못한 결과를 얻는 경우도 있다. 따라서 미생물 분류에도 분자생물학적인 방법을 이용하여, 미생물이 가지고 있는 DNA를 분석하는 방법이 이용되고 있다. 그 타켓의 하나로 유전자의 길이가 비교적 길고, 기능변화에 따른 유전자 변이의 가능성이 낮은 16S rDNA를 사용한다. 보통 계통진화학적으로 의미있는 유전자는 단백질 합성이나 cell component를 coding하는 유전자를 많이 사용하고 있다. 그중에서 세균의 진화나 분류에 의미있는 부분을 Woese가 찾아내었고 그것이 바로 16S rRNA이다.

• 염기서열 분석으로 균종 동정을 실시할 때 가장 중요한 점은 변별력을 높일 수 있는 조건들이다. 염기서열분석은 어떤 표적 유전자를 사용하느냐, 어느 정도 길이의 염기서열을 분석하느냐에 따라 변별력이 다르다. 세균 동정에는 16S rRNA 유전자를, 진균 동정에는 internal transcribed spacer(ITS) 또는 28S rRNA 유전자의 D1/D2 부위를 이용한 염기서열분석법이 가장 많이 이용되지만 일부 균종에서는 이 부위의 균종간 유전자 일치도가 높아 변별력이 떨어지기 때문에 전통적인 표현형 검사를 시행하거나 추가적인 유전자 분석이 필요하다.

• 16S rRNA는 일반적으로 bacteria의 동정에 사용되는데 이에는 몇 가지 이유가 있다.
  첫째, 전통적으로는 bacteria의 분류는 그람(gram) 양성/음성 혹은 간균,구균 등의 phenotype적인 특징에 의해 결정되었다. 하지만 요즘 분류학자들은 생물의 DNA가 phenotype보다 동종에 더 중요하다고 여긴다.
  둘째, 16s rRNA는 1.5kb정도로 비교적 짧기 때문에 적은 비용으로 시퀀싱이 가능하다.
  다시 정리하자면,
  

• DNA barcode로 사용하려면 편재해야함, Bacteria와 Archaea는 16S rRNA를 가지고 있음.
  

• 충분한 phylogenetic 정보를 포함해야함,16S rRNA는 약 1,500bp 길이로 너무 짧거나 너무 길지 않은 적당한 길이를 가지고 있음.
  

• 원핵 생물 중에서 발견된 16S rRNA 유전자 내의 변이는 계통 발생 분석에 사용하기에 적합함.
  

• 같은 속내에서 종 동정을 하는 데 있어 가능성이 있음.
  

• PCR 증폭이 용이함, 16s rRNA 유전자는 primer로서 사용할 수 있는 다수의 보존된 영역을 가지고 있음.
  

• 이는 NGS-based short read sequencing에서 메리트가 됨.
  

• 지금까지 수 많은 연구를 통해 Bacteria 및 Archaea 종을 대부분 보유하는 DB가 있음, 이러한 DB에 match를 시켜보면 왠만한 종들은 식별이 가능함.
  

• 따라서 metagenomics에서는 미생물의 16s rRNA를 이용하여 특정 환경에 존재하는 미생물들을 동정한다.

증폭을 위한 16s rRNA 및 PCR primer의 가변 영역 #

• full length는 27F / 1492R primer를 이용하여 sequencing 진행

NGS Application #

3가지 유형의 NGS sequencing이 가능함.
#

• Single-end sequencing
  

  • DNA 서열 정보는 pcr amplicon의 한 말단에서만 얻어짐.

  • Roche 454, Ion Torrents

• Paired-end sequencing
  

  • DNA 서열 정보는 pcr amplicon의 양쪽 끝에서 얻어짐.

  • Single sequence를 얻기 위해서는 두 sequence를 합치면 됨.

  • Illumina

• Circular consensus sequencing (ccs)
  

  • SMRT 기술을 이용함 (PacBio)

  • 10k bp 이상의 매우 긴 single molcule read를 얻음.

  • circular 모양의 library를 이용하기 때문에 동일한 16s amplicon을 여러번 sequencing함.

  • 그로 인해, 높은 정확도의 consensus sequence를 생성 할 수 있음.

Sequencing formats 추천 #

Reference #

• https://ko.wikipedia.org/wiki/16S_리보솜_RNA
• https://help.ezbiocloud.net/16s-rrna-and-16s-rrna-gene/
• https://pt.slideshare.net/procionesapiente/introduction-to-16s-analysis-with-ngs-bmr-genomics

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