Identification of recurrent regulated alternative splicing events across human solid tumors #

Nucleic Acids Res. 2015 26:5130-44

연구 목적 #

암에서 발생하는 주요 alternative splicing (AS)를 찾아내고자 함

연구 방법 #

① TCGA내 8개 암종에 대한 bam 파일을 download받음

② Q<20 제거

③ STAR aligner로 hg19에 mapping 하고 splice junction(SJ)에 5 bp 미만 overhang이 있는 SJ제거

④ 적어도 5개의 read가 존재하고 upstream SJ와 upstream SJ간 차이가 별로 없는 SJ 도출

⑤ Exon inclusion을 percent spliced-in (PSI)로 도출함 (Figure 1A)

⑥ 이후 RT-PCR로 실험 검증함

연구 결과 #

1. 8종의 암종에서 alternative splicing 분석

① TCGA의 BRCA, COAD, KIRC, LIHC, LUAD, PRAD, HNSC, THCA의 bam 파일을 분석하여 최소 10개의 read정보가 존재하는 exon inclusion, exclusion을 도출한 결과, 47,969개의 cassette exon에서 skipping event가 발생하였음

② PSI에 의거하여 exon inclusion을 분석한 결과, 정상에 비해 암 발생 시PSI change>=10%, FDR<0.05인 1,188개의 skipping event를 발견하였으며 이는 860개의 유전자에 대한 1,173개의 exon에 해당하였음

③ 이 중, 43개의 exon은 이미 암 발생과 관련성이 밝혀져 있음 (예, IGFR, BIN1, RAC1, TNC)

④ skipping event가 발생한 exon이 포함된84개의 유전자의 암 발생 관련성도 이미 보고되었으며 절반 가량에 해당하는 543개의 cassette exon의 alternative splicing은 mouse에서도 보고가 되어 있음

2. 서로 다른 암종에서 공통적으로 발견되는 alternative splicing

① 1/3이상의 splicing event가 한 개 이상의 암종에서 공통적으로 발견되었으며 (430/1,188), 154개의 cassette exon은 암종 간에 non-coherent하게 조절되었음. 특히 KIRC는 다른 암종에 비해 다른 패턴으로 AS 되는 것을 발견함 (그림 2)

② non-coherent하게 AS 되는 49개의 cassette exon 중에서 13개의 exon은 EMT에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 41개의 exon에 포함되어 있었음

③ 6종의 암종에서 같은 패턴으로 조절되는 1개의 exon이 발견되었으며 9개의 exon은 5개의 암종에서 같은 패턴으로 조절되었음 (표1)

④ BRCA, LUAD, COAD 환자의 정상조직 및 암조직으로부터 해당 exon의 AS패턴을 실험 검증하였음 (그림 3)

⑤ FBLN2는 많은 암종에서 methylation되거나 발현 저하되는 것으로 알려져 있으며 5개의 암종에서 exon9이 exclusion되어 있음을 발견하였으며 (그림 4A) exon exclusion 과 발현값 상호간에 밀접한 관련성이 있었으나 (그림 4B) LUAD에서는 이러한 패턴이 발견되지 않았음

⑥ 이러한 AS와 survival과의 관련성을 분석한 결과, 그림 4C에서 보여지는 바와 같이 AP2B1, TCF20, FBLN2의 AS가 1~2개의 암종에서 survival rate와 관련성이 있음을 발견하였음

3. 암 splicing 마커

① 암을 예측할 수 있는 암 특이적인 splicing 패턴이 있는지를 분석하고자 하였음

② 이를 위해 90%이상의 환자 샘플에서 같은 패턴으로 조절되는 AS를 분류하였음 (표2)

③ 찾아진 AS 중 NUMB의 exon9 inclusion은 NSCLC에서 많이 발견되는 것으로 보고되었음

4. 암에서 AS가 발생하는 유전자의 기능

① AS가 발생하는 유전자들은 많은 경우 cytoskeletal organization, cell-cell adhesion, cell movement에 관여하는 유전자들이었음

5. Regulatory motif

① AS에 관여하는 splicing motif를 찾아내고자 주변 250nt내 4~6nt motif를 분석한 결과 upstream intron에는 PTB, CELF, RBFOX, MBNL등의 binding motif가 발견되었으며 downstream intron에는 RBFOX, QKI, MBNL의 binding motif가 발견되었음 (그림 5A)

② RBFOX와 QKI의 binding motif가 많은 경우에 함께 존재하는 것을 발견하였으며 (그림 5B) 이는 QKI와 RBFOX가 함께 타겟을 조절한다는 이전 논문과 같은 결과였음

③ QKI와 RBFOX의 binding motif는 그림 5C에서 보여지는 바와 같이 ACUAAC, UGCAUG이며 AS되는 exon에 더 많이 존재하는 것을 발견하였음

6. Splicing factor의 발현 변화

① Splicing factor의 발현변화를 조사하기 위해 DESeq으로 DEG를 산출하고 RBFOX2, QKI의 발현 변화를 표3에 정리하였음

7. RBFOX2, QKI knock-down 실험과 splicing 패턴 간의 상관성

① RBFOX2, QKI를 knock-down한 실험 결과를 근거로 BRCA, LUAD, PRAD의 PSI 변화와 RBFOX2 knock-down변화 간의 상관 관계를 분석한 결과 그림 6A에서 보여지듯이 positive 상관성이 존재함을 발견하였음

② 반대로 RBFOX2를 과발현한 경우에는 BRCA와 LUAD에서 반대의 상관성이 존재함을 발견하였음

③ QKI를 knock-down한 경우에는 5종의 암에서는 positive 상관성을 보였으며 KIRC와 HNSC에서는 negative 상관성을 보였음 (그림 6B)

[출처 : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25908786]