DNA manipulative enzyme #

유전자 클로닝 실험에서 재조합체를 만들기 위해 벡터와 복제할 DNA를 각각 절단하고 연결해야 한. 이러한 DNA를 조작하기 위해서 효소를 사용한다. 이 글에서는 효소가 어떤 작업을 수행할 수 있는지 알아보기 위해서 DNA manipulative enzyme인 Nuclease, ligase, polymerase, Modifying enzyme에 대해 살펴본다.

Nuclease #

Nuclease는 DNA 가닥에서 nucleotide와 nucleotide를 연결하는 phosphodiester bond를 끊음으로써 DNA 분자를 분해한다. nuclease에는 exonuclease와 endonuclease 두 가지가 있다.

• Exonuclease : DNA 이중 가닥의 끝에서 한 번에 하나씩 nucleotide를 절단한다.
  - Bal31 : 박테리아 Alteromonas espejiana 가 만들어내는 효소로 양 끝에서 상보적 nucleotide 하나씩 분해된다. 시간이 길어질수록 계속해서 절단하기 때문에 생성되는 DNA 조각이 점점 짧아지게 된다.
  

- Exonuclease Ⅲ : E. coli에서 발견되었으며 3’ 말단에서 nucleotide가 하나씩 분해된다.

• Endonuclease : DNA 분자의 중간에서 phosphodiester bond를 끊는다.
  - S1 nuclease : 단일 가닥만을 절단하는 효소이다.
  - DNase Ⅰ : 소의 췌장에서 발견되었고 단일 가닥과 이중 가닥 모두 절단하는 효소이다.
  - Restriction endonuclease : 박테리아와 고세균에서 발견되었고 DNA를 복제하거나 DNA sequencing 할 때 더 작은 조각으로 잘라준다. 이 효소의 작용으로 유전자를 삽입하거나 제거하는 것이 가능하다.

< 그림 . Nuclease >

Ligase #

Ligase는 DNA 가닥을 연결하는 효소로 유기체 내에서 DNA 복제 중에 DNA 이중 가닥에서 발생하는 단일 가닥 손상을 복구한다. 또한 유전자 cloning에서 벡터와 원하는 DNA의 sticky end를 연결한다.

Polymerase #

DNA polymerase는 기존 DNA 또는 RNA 주형에 상보적인 새로운 DNA 가닥을 합성하는 효소이다. 대부분의 polymerase는 DNA 합성이 시작되는 부분인 primer가 있어야만 DNA 합성을 할 수 있다. 대표적 DNA polymerase에는 DNA polymerase Ⅰ, Klenow fragment, Reverse transcriptase로 세 가지가 있다.

• DNA polymerase Ⅰ : E. coli 에 존재하며 DNA가 손상되었을 때 이중 가닥 DNA 분자의 손상된 영역에 부착한 다음 새로운 가닥을 합성하고 기존의 가닥도 분해한 후 다시 합성한다. 대표적인 효소로 Taq DNA polymerase가 있다. 박테리아 Thermus aquaticus 의 DNA 중합 효소이고 유기체가 온천에 살고 있으며 열에 안정적이라서 고온에서도 잘 견딜 수 있다. 따라서 PCR 과정 중 Extention 단계에서 많이 사용된다.
  
• Klenow fragment : DNA polymerase Ⅰ 에서 처음 아미노산 일부를 제거하여 중합효소로써 기능은 유지하지만, DNA를 분해할 수는 없는 효소이다.
  
• Reverse transcriptase : DNA가 아닌 RNA를 주형으로 사용하는 효소로 RNA 주형에 상보적인 DNA 가닥을 합성한다. 이러한 특징은 cDNA cloning 또는 real-time pcr, RNA Sequencing 등에 유용하게 사용된다.

DNA-modifying enzyme #

DNA modifying enzyme은 특정 화학 그룹을 추가하거나 제거하여 DNA 분자를 변형시키는 효소이다. 많은 modifying enzyme이 있지만 alkaline phosphatase, polynuleotide kinase, terminal deoxynucleotidyl transferase 세 가지에 대해 알아본다.

• Alkaline phosphatase : E. coli , 송아지 장 또는 북극 새우에서 발견되는 효소로 DNA 분자의 5’ 말단에 있는 phosphate group을 제거한다. 특히, 송아지의 장에서 발견된 Alkaline phosphatase를 Calf intestinal alkaline phosphatase(CIAP)라고 한다. CIAP는 실험할 때 제한효소로 잘라 놓은 vector가 그냥 다시 붙게 되면 결국 원하는 DNA가 없는 vector만 생성되는 결과가 초래될 수 있는데 이러한 Self-Ligation을 방지하기 위해서 사용된다. CIAP가 5’ 말단에 있는 phosphate group을 제거하면 OH기로 바뀌게 되고 결국 원하는 유전자가 들어갈 수 있게 해준다.
  
• Polynucleotide kinase : T4 phage에 감염된 E.coli 에서 발견되며 5’ 말단에 있는 OH이기에 phosphate group이 추가된다.
  
• Terminal deoxynucleotidyl transferase : 송아지 흉선에서 발견되며 DNA 분자의 3’ 말단에 하나 이상의 deoxyribonucleotide를 추가한다.

출처 #

• https://www.chegg.com/learn/topic/nuclease
• Gene cloning and DNA analysis : An Introduction, Seventh Edition. T.A. Brown. ⓒ 2016 John Wiley & Sons, Ltd. Published 2016 by John Wiley & Sons, Ltd. Companion Website: www.wiley.com/go/brown/cloning