개요 #

Enzymatic methyl sequencing (EM-seq)은 methylation pattern을 파악하기 위해 시퀀싱이 전 단계에서 효소를 처리하는 방법이다. 필요한 효소는 총 3가지로 Tet methylcytosine dioxygenase 2 (TET2),T4 Phage β-glucosyltransferase (T4-BGT)와 Apolipoprotein B MRNA Editing Enzyme Catalytic Subunit 3A (APOBEC3A)로 구성된다.

3가지 효소를 이용하여 총 두 가지 반응이 이루어 진다. 첫 번째 반응은 TET2를 처리하여 methylation된 cytosine는 이산화탄소(CO2)와 Succinate를 형성하면서 산화된다. 산화되어 생성된 중간단계 물질에 T4-BGT 효소를 처리한다. 두 번째 반응은 APOBEC3A를 처리하게 되면 전체 cytosine은 uracil로 conversion이 일어나는데, 앞서 첫 번째 반응에서 T4-BGT 처리한 cytosine은 APOBEC3A에 의한 deamination이 일어나지 않는다. 결과적으로 sequencing을 하게 되면 methylation이 일어나지 않았던 cytosine은 uracil로 conversion된 후 thymine으로 읽히고, methylation이 일어난 cytosine은 그대로 cytosine으로 읽히게 된다.

Bisulfite sequencing과 비교 #

DNA methylation pattern을 파악하는 데에 Gold standard로 사용되고 있는 방식은 bisulfite sequencing이 있다. 그러나 bisulfite를 처리하는 방식은 DNA를 손상시켜 편향된 시퀀싱 데이터를 얻을 수 있다는 문제점이 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해 EM-seq이 개발되었다. EM-seq은 효소를 사용하여 DNA 손상을 줄임과 동시에 bisulfite sequencing보다 균일한 GC 분포, CpG 개수의 증가와 methylation calling의 정확도 면에서 성능이 좋다는 연구 결과가 나왔다.

출처 #

Amanda Hoppers et al 2020: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7424837/ Romualdas Vaisvila et al 2021: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8256858/

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