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SNP genotyping assay #
형광을 통해 bi-allele SNP를 간단하고 신속하게 확인할 수 있는 high-throughput tool이다.
3종류의 primers (STA, LSP, ASP1&2)와 2종류의 probes (FAM, HEX)를 사용하여 Dynamic Array integrated fluidic circuits (IFCs) 상에서 2가지 타입의 SNP를 구분하며, 65%이하의 GC contents에서 80%이상의 성공률을 가진다.Workflow #
Assay design #
Bi-alleles을 가지는 하나의 SNP를 분석하도록 assay마다 3종류 (4개의 primers)를 제작한다. Fluidigm社는 자체 프로그램 (D3 assay design)을 통해 고객의 assay에 적합한 primer sets를 제공하고 바로 주문 가능하도록 하고 있다.
• Specific Target Amplification (STA) primer • Locus-Specific Primer (LSP) • Allele-Specific Primers (ASP) 1 & 2Specific Target Amplification (STA) #
샘플의 양이 적거나 quality가 낮은, gDNA의 길이가 긴 샘플의 경우에 STA를 수행한다. 이를 통해 확인하고자 하는 특정 SNP가 있는 products를 충분히 얻어내게 된다. 또한 결과의 정확도를 높이기 위해 수행하기도 한다. STA는 STA primer와 LSP를 사용하여 10~18 cycles의 PCR을 수행한다.
Dynamic Array integrated fluidic circuits (IFCs) #
Assay mixture와 sample이 섞여 반응이 일어나는 곳이다. Assay와 sample의 수에 따라 4종류의 IFC 중에서 선택한다.
IFC controller는 각 inlet에 있는 assay와 sample을 중앙에 위치한 각각의 chamber로 이동시키고 cell에서 서로 섞여 반응이 일어날 수 있도록 준비하는 장치이다.FC1은 thermal cycler로써 cell에서 섞인 assay와 sample의 반응이 일어나도록 한다. 64℃-61℃으로 1℃ 떨어지는 touchdown PCR과 34 cycles의 PCR을 진행하며 SNP에 해당하는 ASP1 또는 ASP2를 통해 products가 증폭된다. 이 과정에서 ASP1&2에 달려있는 FAM, HEX sequence도 함께 증폭되며, 증폭된 양만큼 발광하는 FAM과 HEX의 신호는 EP1 reader에서 검출된다.
Analysis #
EP1 reader에서 얻어진 데이터는 SNP genotyping analysis software에서 분석이 가능하다. 결과는 XX, XY, YY인 3가지 값으로 나타나며, 이를 통해 sample별 SNP 결과값을 확인할 수 있다.
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