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HPLC #

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HPLC(High Performance Liquid Chromatography) #

HPLC란? #

일반 크로마토그래피와 마찬가지로 고정상과 이동상에 대한 밀접한 차이를 가지는 구성 물질로 이루어진 혼합물을, 구성 물질 간의 이동 속도 차이를 이용해 분리 후 검출기를 통하여 검출하는 장치이다. 일반 크로마토그래피와의 다른 점은 삼투압 혹은 중력을 이용하여 이동상과 구성 물질을 이동시키는 일반 크로마토그래피와는 다르게, HPLC는 pump에 의해 가해지는 압력으로 구성 물질을 이동시킨다. 또한 육안으로 결과를 확인하는 일반 크로마토그래피와는 달리 UV detector와 같은 다양한 detector를 이용하여 결과를 확인한다.

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사용법 #

Column 안에 정제된 혼합물을 삽입하면, 혼합물 안의 구성 물질은 고정상(stationary phase)과의 상호작용에 의해 다른 속도로 이동하게 된다. 이때 특정 분석 물이 column을 완전히 통과하는 데 걸리는 시간을 ‘머무름시간(retention time)’이라고 한다. 만일 같은 분석 조건에서 같은 물질을 분석하게 된다면 retention time은 항상 동일하다고 여긴다. Column 내의 고정상은 대게 레진 bead 형태로 이루어져 있고, bead 입자가 작을수록 column의 분리능이 좋아지며 이론 단수(number of theoretical plates)가 높아진다. 다만 작은 작은 bead 크기로 인해 밀도가 증가하여 column 및 전반적인 기계에 걸리는 압력이 기하급수적으로 증가하기 때문에 무조건 작은 사이즈의 레진 bead가 좋다고 할 수는 없다. 일반적으로 고정상의 종류에 따라 순상(NP, 고정상이 극성), 역상(RP, 고정상이 비극성)으로 구분되고 분석 물질의 물성에 따라 순상 혹은 역상 column을 선택하여서 사용하면 된다. 이동상은 수용성 용매로는 물이, 유기용매로는 아세토나이트릴이나 메탄올이 주로 쓰인다. 일정한 이동상 조성비를 가진 경우 등용매 분리(isocratic separation), 이동상의 조성비가 분석 도중 변하는 경우 구배 분리(gradient elution mode)로 구분된다.


검출기 #

UV #

Lambert-Beer 법칙을 이용하여 ppm 범위의 성분을 측정한다. 흡수 파장의 경우 물질마다 차이가 있기 때문에 어떠한 분석 물질을 사용하느냐에 따라 어떠한 파장의 빛이 사용될지 결정된다. 측정 파장에 따라 단일 파장 혹은 지정된 몇 개의 파장만을 측정하는 VWD, MWD와 지정된 범위의 스펙트럼을 스캔하는 DAD로 구분된다.

FLD #

형광 현상을 이용하여 특정 파장을 조사하고 물질을 검출한다. UVD에 비해 감도와 선택성이 뛰어나지만, 형광물질에 한해서만 분석이 가능하다는 단점이 있다.

CD #

이동상에 녹아있는 이온의 양에 따라 전기전도도가 변하는 것을 측정하여 이온 양을 검출한다.

RID #

농도에 따라 발생하는 굴절률의 차이를 통해 물질을 검출하는 검출기로, 흡광도로는 검출할 수 없는 당, 고분자 등의 분석에 사용된다.

ELSD #

이동상에 열을 가하여 기화시킨 뒤 흩뿌리고 레이저를 조사하여 산란되는 정도를 통해 검출한다. 다만 시료의 휘발성이 강할 경우 사용하기 힘들다는 단점이 있다.

MS #

질량 분석을 통해 정성 및 정량 분석이 가능한 검출기이다. 원하는 질량의 분자만을 선택적으로 검출하기 때문에 다른 검출기에 비해 높은 선택성을 제공한다.

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