Primer3 #

Primer3 는 Whitehead Institude/MT Center for Genome Research에서 개발된 것으로 PCR과 real time PCR 실험에서 도출된 nucleotide sequence로부터 PCR용 primer를 디자인해주는 무료 온라인 프로그램이다. (명령행 프로그램도 별도로 존재한다.)

시퀀싱 반응을 위해 single 프라이머를 선택할 수 있고 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 디자인할 수 있다. 이 온라인 도구는 몇가지의 중요한 기능들을 탑재하고 있다.

프라이머 탐지, 클로닝, 시퀀싱과 프라이머 Listing 등의 특징을 갖고 있다.

온라인 프로그램 사용 방법 #

1. 다음 링크를 통해서 Primer3에 접속할 수 있다. 1
2. Primer를 선발할 타겟 시퀀스를 입력한다. 타겟시퀀스는 NCBI의 RefSeq 데이터베이스에서 얻을 수 있다. Primer3 프로그램은 FASTA형식을 읽기 때문에 FASTA 포맷의 파일을 입력한다. FASTA파일이 없는 경우, 시퀀스를 입력창에 그대로 붙여넣기 할 수 있다. 그 후, mispriming library 종류(ex. Human, mouse)를 선택한다.
3. Sequence Id 옵션을 설정한다.
   • Sequence Id : Sequence 이름을 뜻하며 임의로 입력할 수 있다.
   • Product seze ranges : 증폭될 PCR 산물의 크기를 정하여 입력한다.
4. 프라이머를 선택할 조건을 입력한다. Primer 사이즈는 사용할 Primer의 염기수이며 Primer Tm의 범위를 설정하고 최적 조건을 입력한다. CG clamp는 Primer의 3’end로부터 연속적으로 존재하는 CG의 수를 말한다.
5. Pick Primer 버튼을 선택하면 다음창으로 넘어간다.
6. 제시된 Primer 쌍 중, 적절한 것을 선택한다. 제시되는 Primer수는 기본적으로 5개이며 ‘Number to return’ 옵션에서 조절할 수 있다. 가장 적절한 Primer순서대로 위에서부터 나열된다. Primer 시퀀스는 왼쪽이 5’end, 오른쪽이 3’end 이다.
7. 제시된 Primer로 합성된 PCR산물의 크기(Product size)가 Primer정보 아래 표시된다. 그리고 전체 Sequence에서 Primer 위치를 보여준다. Forward primer는 ‘>’ 로 Reverse primer는 ‘<’로 표시된다.

Primer sequence는 알고 있으나 Tm 정보를 모를 경우, Oligonucleotide Calculator을 통해 자동으로 계산하거나 따로 계산식에 대입하여 구할 수 있다.

명령형 프로그램 #

1. 다음 링크를 통해서 Primer3 프로그램을 다운받는다. 2

2. Primer를 선발할 타겟 시퀀스의 정보를 포함하고 있는 config 파일을 생성한다. config 파일의 예시는 아래와 같다. 더 자세한 설명은 Primer3 manual page 3를 참조하면 된다.

   SEQUENCE_ID=GENE1
   SEQUENCE_TEMPLATE=GENE1 SEQ
   SEQUENCE_TARGET=
   PRIMER_TASK=pick_detection_primers
   P3_FILE_FLAT=1
   PRIMER_FIRST_BASE_INDEX=1
   PRIMER_MAX_NS_ACCEPTED=1
   PRIMER_EXPLAIN_FLAG=1
   PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE=80-120
   PRIMER_PRODUCT_OPT_SIZE=100
   PRIMER_NUM_RETURN=50
   PRIMER_THERMODYNAMIC_PARAMETERS_PATH=[PRIMER3_PATH]
   =
   

3. 생성된 primer3의 config파일로 primer3를 실행하면 된다. primer3 실행 커맨드는 아래와 같다.

   [PRIMER3_PATH]/primer3_core [-format_output] [-default_version=1|-default_version=2] [-io_version=4] [-p3_settings_file=<file_path>] [-echo_settings_file] [-strict_tags] [-output=<file_path>] [-error=<file_path>] [input_file]
   

References #

• Primer3 (web-based) 1
• Primer3 sourceforge (command) 2
• Primer3 Manual 3

Suggested Pages #

• 0.025 mispriming
• 0.025 IUPAC명명법
• 0.025 sequence
• 0.025 Genbank
• 0.025 Genome
• 0.025 Esummary
• 0.025 Esearch
• 0.025 Elink
• 0.025 Entrez utils
• 0.025 esummary
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