Sanger 법 #

개요 #

프레더릭 생어(Frederick Sanger, 1918.08.13~2013.11.19, 유전체학과 단백체학을 최초로 연구한 영국 케임브리지대학 MRC센터의 과학자)가 개발한 효소적 방법으로, dideoxynucleotide를 이용하는 사슬 종결(chain termination) 기술이다. DNA합성 메커니즘을 기반으로 서열을 분석할 DNA의 단일 가닥 부위를 주형으로 사용한다.

원리 #

이 방법에는 DNA 사슬이 연장되는 것을 특이적으로 종료시키는 물질인 dideoxy nucleoside triphosphate (ddNTP)가 사용되는데, 이것은 3‘위치에 –OH(수산화기) 대신에 -H를 함유한다. 3‘OH가 결여되어 있으므로, 다른 deoxynucleotide처럼 DNA 중합효소에 의하여 5’-triphosphate에 결합해 DNA사슬에 끼어들지만, 3’말단의 –OH(수산화기)가 없으므로, DNA중합효소가 DNA가닥을 이어주는 이인산 에스테르 결합(phosphodiester bond)을 하지 못해 합성이 종결되는 원리를 이용하여 DNA서열을 조사하는 것이다.

방법 #

주형가닥, 시발자, 4가지의 dNTP, DNA중합효소를 함유하고 있는 4개의 시험관 각각에 ddNTP 중 하나씩을 첨가하여 반응을 시킨다. 예를 들어, G반응 시험관에는 ddGTP를 포함하고, 그 시험관에서 만들어진 각가의 사슬은 ddGTP가 결합할 때까지 계속 합성될 것이다. 그러므로 이 반응에서 합성되는 각각의 DNA 사슬은 G지점에서 끝나게 되는데, 끝나는 G지점은 무작위적이고, 우연히 ddGTP가 사슬로 들어가게 되었을 때 결정되다. 다른 시험관도 이와 같은 원리로 반응된다. 따라서 각 반응마다 서로 길이가 다른 DNA들이 만들어지게 되고 전기 영동하여 길이에 따라 분리하면, DNA사슬의 크기에 따라서 분리된다. DNA서열화 반응에서 dNTP 중 하나를 방사성 동위원소로 표지하거나 dideoxynucleotide각각을 다른 색의 형광염료로 표지해 이를 방사선자동사진법(autoradiography)으로 분석해 염기의 서열을 확인한다. 현재는 자동화기기를 이용하여 형광 염료의 색으로 염기서열 분석을 쉽게 수행한다.

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