Sanger sequencing #

Sanger sequencing은 1977년에 Frederick Sanger에 의해 개발된 방법으로, 기본적으로 polymerase chain reaction (PCR) 과정에서 di-deoxynucleotide triphosphates (ddNTPs)에 의해 DNA strand가 합성되지 않는 chain termination의 원리와, 전기영동의 원리를 이용하여 염기서열을 확인하는 방법이다.

Sanger sequencing 원리 #

Sanger sequencing을 이해하기 위해서는 우선적으로 PCR 과정 대해 이해할 필요가 있다. DNA 서열 증폭을 위해서는 DNA를 구성하는 기본 단위인 deoxynucleotide triphosphate (dNTP)가 필요하다. DNA 서열에 dNTP가 중합될 때, DNA 서열 마지막 nucleotide 3번 탄소의 수산화기(-OH)와 새로운 dNTP 5번 탄소의 인산기가 반응하여 결합된다. Sanger sequencing 원리의 핵심은 ddNTPs에 있다. ddNTP는 dNTP의 3번 탄소에 산소(oxygen)이 존재하지 않는, 즉 수산화기(-OH) 대신 수소(-H)가 결합되어 있는 nucleotide 구조이다.

Fig1. ddNTP 구조

그림출처 : http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/molstudents/01licohen/sequencing.html

Sanger sequencing을 진행할 때는 dNTP에 추가적으로 소량의 ddNTP가 포함된 PCR을 우선 진행한다. 이 때, 4 가지의 ddNTP (핵산별로 ddATP (아데닌), ddGTP (구아닌), ddTTP (티민), ddCTP (사이토신))는 서로 다른 형광물질로 염색되어 있다. PCR 과정에서 DNA가 증폭되던 중 우연히 dNTP 대신 ddNTP가 결합된 경우, ddNTP의 3번 탄소에는 수산화기가 없으므로 더 이상 새로운 인산기가 결합될 수 없어 증폭이 중지된다 (chain termination). ddNTP의 결합은 무작위적으로 일어나게 되므로, 수 많은 증폭과정을 통해 거의 모든 염기서열 위치에서 chain termination이 일어나게 된다.

1차적으로 ddNTP를 포함한 PCR이 완료된 후에는, 염기서열을 크기에 따라 작은 순서대로 정렬할 수 있는 전기영동을 이용하여 증폭된 서열을 정렬한다. 크기순으로 정렬된 서열의 순서대로 형광 신호를 인식시키면, 염기서열 순서대로 해당 염기 서열에 해당하는 핵산 정보가 각 서열 끝에 마지막으로 결합된 ddNTP가 가지고 있던 형광물질 종류에 따라 읽히게 된다.

Fig2. Sanger sequencing 원리

그림출처 : http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/www.piopio.school.nz/molmed.htm

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