Single cell RNA-seq #

단세포의 전사체를 분석하는 방법

배경 #

현재까지는 세포 집단의 전사체를 연구했지만, 세포 각각의 발현 양상이 상이하기 때문에 정확한 연구 결과에는 한계가 있었다. DNA와 RNA를 bulk sequencing 하는 경우 비용 부분에서의 장점은 존재하지만, 조직 단위의 시퀀싱을 수행하다 보니 암 조직을 시퀀싱 하는 경우 해당 암 조직 내에 존재하는 정상 세포들을 온전히 고려하지 못하고 분석을 수행하여야 했다. 따라서 bulk sequencing으로는 여러 종류의 세포가 존재하는 암 미세환경을 파악하기 위한 분석에서 한계점이 존재했다. 여러 연구자와 개발자들이 bulk sequencing 결과로부터 cell type의 비율을 de convolution 하는 방법을 개발하였지만, reference data가 필요한 방법론이 주류였으며 reference-free method도 검증과정을 수행하여야 하는 제약사항이 존재하였다. 또한, 세포 단위의 분석을 통해서 세포들의 상호작용과 조직의 기능을 연구하고자 하는 수요가 존재하였고 오늘날에 이르러 Fluidigm, 10X genomics, Illumina, Takara Bio 사에서 Single cell sequencing platform을 개발하여 시장에 공급하고 있다.

방법 #

단일 세포 분석을 수행하는 방법으로는 10X genomics 사의 플랫폼을 기준으로 설명하며 크게 4가지 과정을 거친다.

1. Tissue Dissociation
2. Single cell capture
3. Library preparation and sequencing
4. Computational protocol

1. Tissue Dissociation #

Single cell을 만드는 방법 중에 한가지로 Flow-activated cell sorting(FACS) 방법이 있다. FACS는 형광 인자가 표지된 항체로 해당 항원을 발현하는 세포를 구별하고 다른 항원들도 동시에 구별할 수 있지만, 항체가 필요하다는 단점이 있다.

2. Single cell capture #

조직에서 단일 세포 단위로 분리된 현탁액은 microfluidics chip을 사용해서 각 세포를 하나의 bead로 둘러싸게 한다.

3. Library preparation and sequencing #

앞서 bead 단위로 세포를 둘러싼 이유는 시퀀싱 단계에 앞서 세포 단위로 데이터를 구분할 수 있는 바코드를 bead 별로 증폭함으로써 이를 통해 각 세포는 독립적인 바코드 정보를 지니게 된다.
현재는 수천 개의 single cell cDNA 라이브러리를 합성하기 위해 SAMRT-seq 방법이 많이 사용되는 추세이다. 이에 Clontech 에서는 고유의 SMART(Switching Mechanism At the 5’-end of RNA Transcript) 기술을 이용하여 single cell을 이용한 RNA-seq에 적합한 cDNA를 만들 수 있는 제품이 출시된 바 있다.

4. Computational protocol #

바코드 정보가 붙은 라이브러리를 시퀀싱 하게 되면 bcl파일을 초기의 시퀀싱 데이터로서 얻게 된다. 이 bcl 파일은 cellRanger라는 10x genomics 사의 소프트웨어를 사용해 fastq 파일을 거치게 되고 최종적으로 바코드(세포)별 유전자 발현 정보를 matrix 파일을 얻게 된다. 이 matrix 파일을 향후 분석에 사용하게 된다.
전처리가 완료된 RNA-seq 데이터를 추가로 분석하기 위해 프로그래밍3 언어인 R에 기반을 둔 여러 가지 package들(e.g.bioconductor, edge R, Singular)이 사용되고 있다.

현황 #

2004년에 첫 단일 세포 분석 연구가 발표된 후 단일 세포분석은 2020년 기준으로 매달 50개의 단일 세포 분석 연구에 대한 논문이 게재되고 있으며, 2013년 이후로는 매달 하나의 데이터베이스가 등록되고 있을 정도로 활발하게 연구되고 있는 분야이다. 일반적인 단일 세포분석은 각 연구에서 얻어진 단일 세포의 시퀀싱 데이터로부터 각 세포를 t-SNE나 UMAP과 같은 차원축소방법을 사용해 세포들을 군집화함으로써 “cell type”을 분류하는 분석이 이루어진다. 또한, 세포군들이 분화하는 과정을 분석하기 위해서 각 세포의 pseudotime을 계산함으로써 시각화하는 연구가 이루어지기도 한다.

전망 #

Single cell RNA-seq 분석은 환자의 임상적 척도를 나타내는 데 유용하게 활용될 수 있다. 정상 조직과 암 조직을 비교해 악성 세포의 비율을 확인할 수 있으며 bulk sequencing data에 비교하면 원하는 세포에 좀 더 특이적인 마커를 발굴하는 것이 가능하다. 또한, 암 조직 내에서 면역 세포들의 비율을 파악하는 것에도 활용할 수 있다. 환자의 예후나 처방에 따라 암 조직 내의 면역 세포들의 반응과 변화를 관찰함으로써 좀 더 환자에 맞춰진 정밀 의료를 행할 수 있을 것이다. 아직은 단일 세포 데이터에서 data resolution이 낮은 편이지만 지난 5년간 실험 기술이나 data imputation 기법의 진보가 이루어져 왔으며, 단일 세포 전사체 데이터뿐만 아니라 단일 세포에서 DNA, 메틸레이션을 보는 실험기법 또한 개발되어 기술적 이점이 큰 상황이다. 기존 실험 및 분석에서 확인하지 못했던 새로운 Cell type이나 질병 마커를 발굴하는데 Single cell RNA-seq 기법이 더욱 활용될 것으로 기대한다.

reference #

1. http://www.ksmcb.or.kr/board/list.html?num=3988&start=0&sort=top%20desc,pos%20asc,num%20desc&code=bbs15&period=&&title=05&key=&keyword=
2. http://totalomics.kr/index.php/%EB%B6%84%EC%84%9D%EC%9E%A5%EB%B9%84%EC%86%8C%EA%B0%9C_2014_09%EC%9B%94%ED%98%B8
3. https://doi.org/10.1093/database/baaa073
4. https://takara.co.kr/file/manual/pdf/2018-ABRF-Poster-GRG-Chittur.pdf
5. https://www.nature.com/articles/s12276-018-0071-8, https://medicine.uiowa.edu/humangenetics/genomics-division/genome-sequencing/single-cell-expression-analysis-scrna-seq
6. https://doi.org/10.1128/MMBR.68.3.538-559.2004

Incoming Links #

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