Visium Spatial Gene Expression #

Visium Spatial Gene Expression, 약칭 Visium 은 샘플의 공간상의 배치를 고려하여 유전자 발현 정보를 시퀀싱 할 수 있는 플랫폼이다.
Bulk RNA sequencing의 경우 분석하고자 하는 샘플의 전반적인 유전자 발현 정보를 얻어낼 수 있으며 Single cell RNA sequencing의 경우는 개별 세포들의 유전자 발현을 확인함으로써 샘플에서 세포들의 조성과 각 세포 유형별로 유전자 발현의 차이를 확인할 수 있었다.
하지만 두 시퀀싱 방법 모두 어떤 병리학적 위치에서 유전자 발현의 차이가 발생하는지를 확인할 수는 없었다.
반대로 In Situ Hybridization의 경우 일부 유전자와 단백질의 발현을 조직 슬라이드 상의 위치에서 확인할 수 있으나 전사체의 발현을 모두 아는 것은 불가능하였다.
Visium은 이 두 플랫폼의 단점을 극복하여 조직 슬라이드에서 전체 mRNA의 발현을 측정하고 해당 유전자 발현이 발생하는 위치를 맵핑함으로써 조직 슬라이드 이미지 위에서 맵핑된 spot에 대한 유전자 발현 정보를 제공한다.

Visium Spatial Gene Expression 실험 #

서로 다른 위치에서 발현하는 유전자 발현정보를 조직 슬라이드 위에 맵핑하기 위해서 아래 이미지와 같은 캡처 영역을 구성하여 spot마다 특이적인 Spatial Barcode를 두어 시퀀싱 하도록 되어 있다.

각 Spot의 모든 프라이머는 같은 Spatial barcode를 공유하고 cDNA를 합성하여 mRNA 시퀀싱을 수행한다.

실험을 수행하는 과정은 아래와 같다.
1. 슬라이드 조직의 고정 및 염색.
2. mRNA capture
3. cDNA amplification
4. Visium library Construction
5. 시퀀싱 수행

Visium Data analysis #

Seurat 예제 #

Visium Dataset의 분석은 Single cell Dataset과 마찬가지로 Seurat이라는 R library를 사용하여 분석할 수 있다.

# 아래의 라이브러리를 사용하여 예시 분석을 수행할 수 있다.
library(Seurat)
library(SeuratData)
library(ggplot2)
library(patchwork)
library(dplyr)

InstallData("stxBrain")
brain <- LoadData("stxBrain", type = "anterior1")

해당 brain 객체의 데이터 구조를 확인해본다면 2,696개의 spot에 대하여 31,053개의 유전자 발현 정보를 제공한다.

plot1 <- VlnPlot(brain, features = "nCount_Spatial", pt.size = 0.1) + NoLegend()
plot2 <- SpatialFeaturePlot(brain, features = "nCount_Spatial") + theme(legend.position = "right")
wrap_plots(plot1, plot2)

위 코드를 사용한다면 아래와 같이 brain 객체에 있는 meta data 중 nCount_Spatial slot의 값에 대하여 바이올린 플롯과 2,696개의 spot 에 대한 값을 슬라이드 이미지 위에서 확인할 수 있다.

유전자 발현 값을 보기 위해서는 raw count 값을 확인할 수도 있으나 최소한 한차례의 정규화(Normalization) 과정을 수행한 후 유전자 발현 값을 확인하는 것이 권장된다.
예시 코드에서 정규화 과정은 SCTransform 함수를 사용하여 진행되었다.

유전자 발현 값 또한 바이올린 플롯이나 슬라이드 이미지 위에서 확인하는 것이 가능하다.

brain <- SCTransform(brain, assay = "Spatial", verbose = FALSE)
SpatialFeaturePlot(brain, features = c("Hpca", "Ttr"))

추가적인 분석은 하단 Reference 탭의 Spatial vignette의 링크를 참조하여 진행해볼 수 있다.

Loupe Browser 예제 #

초록에서 Visium이 조직 슬라이드에서 활용되었다고 언급하였다.
Visium Dataset은 Seurat에서 그러했듯이 Loupe browser를 사용해서도 확인할 수 있다. 특히 H&E staining image와 같이 병리학자분들이 조직 슬라이드에 대해서 주석화(annotation)를 진행하시는 경우 Loupe browser의 브러시와 올가미 도구를 사용하여 각 spot에 대한 annotation을 진행할 수 있다.
주석화를 완료하였다면 Export Pathologist Annotation 버튼을 클릭하여 텍스트 형식으로 결과를 저장할 수 있다.

저장된 병리학적 주석화 파일에는 Barcode 라는 각 Spot 별 ID 가 부여되어 있다.
이를 사용하기 위해서는 앞서 "Seurat 예제"에서 진행한 방식대로 Visium Dataset을 로드한 후 Visium 객체에 저장된 meta data 중 "orig.ident"를 확인해야 한다.
"orig.ident"에서 확인한 Barcode ID와 동일하게 주석화 정보를 정렬하여 meta data에 저장한다면 해당 Visium 객체에서 주석화 정보를 사용할 수 있게 된다.

Reference #

1. https://www.10xgenomics.com/support/spatial-gene-expression-fresh-frozen/documentation/steps/library-construction/visium-spatial-gene-expression-reagent-kits-user-guide
2. https://pages.10xgenomics.com/rs/446-PBO-704/images/10x_LIT000128_PS_Spatial_biology_without_limits_Spatial_gene_expression_in_FFPE.pdf
3. https://satijalab.org/seurat/articles/spatial_vignette.html
4. https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360058943912-How-can-I-transfer-pathologist-annotations-to-Loupe-Browser-